Определение последовательности разрушения элементов структуры зеленого флуоресцентного белка при его тепловой денатурации

• Автор: Поварницына, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание.
Введение
Глава I. Литературный обзор
1. Проблема сворачивания белка
1.1. Одностадийно сворачивающиеся белки
1.2. Многостадийно сворачивающиеся белки
2. Характеристика объекта исследования
2.1. Особенности структуры зеленого флуоресцентного белка
2.2. Механизм формирования хромофора
2.3. Спектральные характеристики вБР
2.4. Гомологи ОБР
2.5. Олигомеризация вГР-подобных белков
2.6. Сравнение физико-химических свойств вБР дикого типа и ОГР-сус1е3.
2.7. Денатурационные переходы вГР-сусІеЗ
3. Калориметрические исследования
3.1. Модель Ламри-Эйринга
3.2. Модель одностадийной необратимой денатурации
3.3. Модель денатурации белка, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии
3.4. Модель Ламри-Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием на первой стадии
3.5. Критерии для одностадийной необратимой денатурации
4. Мутационный анализ
4.1. Исследование переходного состояния белка методом
ф- анализа

4.2. Влияние одиночных замен аминокислотных остатков на кинетические параметры процессов сворачивания/разворачивания различных белков
5. Дисульфидные связи
Глава II Материалы и методы
Глава III. Результаты и обсуждение
1. Исследование физико-химических свойств GFP-cycle
2. Калориметрическое плавление GFP-cycle
3. Прямой кинетический эксперимент по разворачиванию GFP-cycle3 температурой
4. Сравнение констант скоростей, рассчитанных из калориметрических данных и из прямого кинетического эксперимента
5. Теоретический анализ кристаллической структуры зеленого флуоресцентного белка из A.victoria
6. Влияние замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов и введения ss-мостиков на энергетический ландшафт многостадийно сворачивающихся белков
7. Кинетические исследования мутантных форм GFP-cycle
8. Анализ влияния мутаций на GFP-cycle
Заключение
Выводы
Список литературы

Введение.
В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных направлений в биологии и медицине стало развитие методов прижизненной визуализации процессов, происходящих в клетке и организме с помощью флуоресцентных красителей. Исключительное место среди флуоресцентных маркеров занимает зеленый флуоресцентный белок, а также его варианты и гомологи. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) медузы Aequorea victoria был впервые описан более 40 лет назад, но широкую известность получил только в 90-е годы после того, как удалось клонировать ген GFP и показать, что этот белок становится флуоресцентным при его синтезе практически в любом организме.
Сегодня GFP широко используется для флуоресцентного мечения белков, органелл и клеток в различных видах прокариот и эукариот. Но, несмотря на широкое применение GFP в клеточной биологии, работ по изучению физикохимических свойств этого белка мало, к тому же литературные данные имеют противоречивый характер. Например, существует распространенное мнение, что этот белок разворачивается только при высоких температурах. При этом, известно, что не получается использовать GFP как маркер в термофильных организмах. Такого рода противоречия возникают из-за недостатка исследований стабильности, скоростей сворачивания и последовательности формирования различных промежуточных состояний этого белка. В данной работе мы исследовали стабильность и скорости разрушения структуры белка GFP-cycle3 (мутантная форма GFP с тремя заменами аминокислотных остатков), а также использовали совершенно новый подход, с помощью которого сумели выяснить последовательность разрушения элементов вторичной структуры GFP-cycle3.
Такого рода исследования важны не только для определения физикохимических свойств зеленого флуоресцентного белка. Выяснение механизмов формирования/разрушения промежуточных состояний многостадийно сворачивающихся белков - одна из важнейших задач биофизики. Решение этой
3.3. Модель денатурации белка, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии.
Более сложным частным случаем модели Ламри-Эйринга (1) является модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии:
ТУ —^и—^>£>. (2)"
Эта модель реализуется для ситуации, когда скорость обратной реакции на первой стадии мала по сравнению со скоростью второй стадии. В отличие от одностадийной необратимой модели, в данном случае скорость прямой реакции первой стадии сравнима по величине со скоростью второй стадии.
Кинетическое поведение системы, описываемой моделью (2)7/, определяется
системой дифференциальных уравнений:
, КГ N ,,
Л , (3/
ку -кг '
,, ~ КУ N К2 Уи ш
где ук и уи ~ соответственно молярная доля нативного и частично развернутого белка. При постоянной скорости сканирования у=с177сй (Т - абсолютная температура, £ - время) система уравнений (3)7/ преобразуется в систему:
с1Т V ' К _ /4у/
“Ёг = “(*,Ь-кгуи) аТ V
Первое уравнение системы (4)/7 решается так же, как и в случае одностадийной
модели (З/. Следовательно,
Ун = ехр

- [к,(ГГ / *

Подставляя выражение ум из уравнения (5) во второе уравнение системы (4) , получаем: