Молекулярная характеристика герминальной гранулы, участвующей в репрессии повторов Stellate в семенниках Drosophila melanogaster

• Автор: Кибанов, Михаил Викторович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
X. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.3 Научная новизна результатов исследования
1.4 Практическая ценность
1.5 Апробация работы
Объем диссертации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 РНК-САЙЛЕНСИНГ И КОРОТКИЕ РНК
2.1.1 siPHK и esiPHK
2.1.2 miPHK
2.1.3. piPHK
2.2 Сперматогенез Drosophila melanogaster
2.3 Герминальные гранулы Drosophila melanogaster
2.3.1 Полярные гранулы
2.3.2 Nuage
2.4 Герминальные гранулы млекопитающих
2.4.1 Pi иpiP-body в гониоцитах млекопитающих
2.4.2 Хроматоидное тельце: открытие и структура
2.4.2 Подвижность хроматоидного тельца
2.4.3 Компоненты хроматоидного тельца
2.4.4. Транспорт в хроматоидное тельце
2.4.5. Хроматоидное тельце и деградация Белков в клетке
2.4.6 Функции хроматоидного тельца
2.5 Метилирование белков герминальных гранул
2.5.1 Аргининметилтрансферазы
2.5.2 Метилирование белков системы piPHK-сайленсинга
2.5.3 Tudor-домен-содержащие белки
2.5.4 Функциональное значение метилирования белков подсемейства PIWI
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
3.2 ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЦЕЛЫХ СЕМЕННИКОВ
3.3 Конфокальная микроскопия
3.4 Получение лизатов для электрофореза и Вестерн-блот анализа
3.5 Электрофорез в денатурирующих условиях и Вестерн-блот анализ
3.6 Антитела
3.7 Выделение тотальной РНК Drosophila для Нозерн-блот гибридизации
3.8 Нозерн-блот гибридизация коротких молекул РНК

4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 ГЕРМИНАЛЬНЫЕ ГРАНУЛЫ В СПЕРМАТОЦИТАХ DROSOPHILA
4.2 ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА СУЩЕСТВОВАНИЯ PlNG-BODY
4.3 Архитектура piNG-body
4.4 Мутационный анализ: разрушение piNG-body и дерепрессия генов Stellate
4.5 Влияние метилирования остатков аргинина на формирование piNG-body
5-ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. ЛИТЕРАТУРА

1. Общая характеристика работы
1.1 Актуальность проблемы
Герминальные клетки многих видов эукариот содержат специфические
рибонуклеопротеиновые гранулы, выявляемые на электронных микрофотографиях по
повышенной электронной плотности. В процессе овогенеза Drosophila эти гранулы
образуют околоядерную структуру, называемую nuage, в питающих клетках ооцита и
полярную плазму на заднем полюсе развивающегося ооцита. Показано, что nuage
вовлечен в трансляционный контроль некоторых мРНК, транспортируемых из ядра-
(Findley et al, 2003; Snee & Macdonald, 2004). Недавние исследования выявили участие
компонентов nuage в биогенезе piPHK (коротких РНК, ассоциированных с белками
подсемейства PIWI), а также в piPHK-зависимом сайленсинге ретротранспозонов и
некоторых других вредоносных элементов генома (Lim & Kai, 2007; Lim et al, 2009).
piPHK-путь представляет собой эволюционно консервативный механизм защиты
целостности генома в герминальных тканях эукариот (Aravin et al, 2007; Thomson &
Lin, 2009). У Drosophila melanogaster белки подсемейства PIWI семейства
ARGONAUTE — Piwi, Aubergine (Aub) и Argonaute3 (AG03), — ассоциированные с
короткими РНК длиной 25-30 нуклеотидов, являются ключевыми участниками-piPHK-
пути (Aravin et al, 2001; Brennecke et al, 2007; Gunawardane et al, 2007; Li et al, 2009;
Vagin et al, 2006). Aub взаимодействует преимущественно с анти-смысловыми piPHK,
происходящими из специализированных «мастер-локусов» в геноме, тогда как AG03
главным образом ассоциирован со смысловыми piPHK (Li et al, 2009; Nishida et al,
2007). В яичниках Drosophila Aub и AG03 осуществляют посттранскрипционный
сайленсинг посредством так называемого «пинг-понгового» амплификационного
цикла: транскрипты мобильных генетических элементов, поступая в антисмысловые
Aub-piPHK-содержащие комплексы (anti-sense piRISC, piRNA-induced silencing
complex), разрезаются до коротких смысловых piPHK; эти вновь образованные piPHK
формируют комплексы с AG03 (sense piRISC), в которых, в свою очередь,
распознаются и процессируются длинные антисмысловые транскрипты с образованием
антисмысловых piPHK; антисмысловые piPIIK формируют комплексы с Aub, и процесс
повторяется циклически (Brennecke et al, 2007; Ghildiyal & Zamore, 2009; Gunawardane
et al, 2007). Цикл piPHK амплификации, по-видимому, происходит в околоядерных
РНП-содержащих гранулах nuage питающих клеток ооцита (Li et al, 2009; Lim & Kai,
2007; Lim et al, 2009; Malone et al, 2009). Вместе с Aub и AG03 такие белки, как
Maelstrom, Krimper, Spindle-E, Squash, Zucchini, Cutoff и Tejas необходимы для piPHK-

Пренатальный период
(Дни)
Постнатальный период

| 3 6 10
S ПрЛ Л 3 п д_
СГ Ранние СПЦ Поздние СПЦ
Ml и МП

Уровень транскрипции
— MIWI2
MIWI
Рис. 7. Схема сперматогенеза мыши
Первичные половые клетки (ППК) в базальном слое эпителия семенных канальцев являются источником недифференцированных клеток - гониоцитов (ГН) и сперматогониев (СГ) - и обеспечивают продукцию гамет на протяжении всего периода половой зрелости особи. Сперматогонии после нескольких митотических делений превращаются в сперматоциты (СПЦ), в которых запускается программа подготовки к редукционному делению. Мейоз состоит из нескольких стадий (ПрЛ -пролиптотена, Л - липтотена, 3 - зиготе на, П - пахитена, Д - диплотена), в ходе которых образуется синаптонемальный комплекс, происходят кроссинговер и гомологичная рекомбинация. Два последующих деления (MI и МИ) завершаются образованием гаплоидных круглых сперматид (КС), которые в процессе спермиогенеза подвергаются существенной трансформации. В удлиненных сперматидах (УС) ядро существенно уменьшается в размере, хроматин компактизуется, а гистоны замещаются протаминами, образуются акросома и жгутик. Во время сперматогенеза наблюдаются два периода активной транскрипции: в поздних сперматоцитах (СПЦ) и постмейотических круглых сперматидах (КС). Вследствие сильной компактизации хроматина транскрипция постепенно выключается в удлиненных сперматидах (УС) и практически полностью отсутствует в зрелых сперматозоидах (СП). Различные формы nuage в эмбриональных гоноцитах (pi- и piP-bodies), поздних сперматоцитах (IMC) и круглых сперматидах (СВ) обозначены красным. Формирование СВ начинается в поздних сперматоцитах и завершается в круглых сперматидах. В удлиненных сперматидах СВ постепенно деградирует. Приведен также профиль экспрессии белков piPHK-пути (MILI, MIWI и MIWI2), необходимых для образования piPHK (Meikar et al, 2011).
По мере дифференцировки круглых сперматид размер СВ увеличивается. Однако на стадии удлиненных сперматид СВ перемешается в область шейки (neck region) и постепенно уменьшается (Fawcett et al, 1970; Onohara et al, 2010). Позднее CB обнаруживается в вытянутой цитоплазматической доле сперматид, где оно плотно окружено лизосомальными везикулами (Susi & Clermont, 1970). Постепенно СВ редуцируются до небольших скоплений плотного материала (Onohara et al, 2010).