Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени

• Автор: Щербаков, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Список используемых сокращений
2. Введение
3. Обзор литературы
3.1. Патогенные для человека ортопоксвирусы
3.1.1.Вирус оспы обезьян
3.1.2.Вирус оспы коров
3.1.3.Вирус осповакцины
3.1.4.Вирус натуральной оспы
3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР
3.2.1.ПЦР в реальном времени
3.2.1.1 .Использование интеркалирующих красителей
3.2.1.2.Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку ПЦР-продукта
3.2.2. Мультиплексная ПЦР
3.2.3.Практическая реализация мультиплексной ПЦР в реальном времени
3.2.4. Место МПЦР в реальном времени в комплексе методов диагностики ортопоксвирусных инфекций человека
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.2. Препараты ДНК штаммов вирусов, использованные в работе
4.3. Выделение ДНК вирусов оспы обезьян, оспы коров и осповакцины из инфицированной клеточной культуры
4.4. Компьютерный анализ
4.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick фирмы «QIAGEN», Г ермания
4.6. Секвенирование ДНК
4.7. Трансформация с применением хлористого кальция
4.8. Выделение плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep фирмы «QIAGEN», Германия
4.9. Выделение ДНК при помощи набора QIAamp DNA Mini Kit фирмы «QIAGEN», Германия
4.10. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
4.11. Лигирование ДНК векторной плазмиды с встраиваемой ДНК амплификационного фрагмента
4.12. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле
4.13. Проведение ПЦР в реальном времени
4.14. Получение клинических образцов вируса оспы обезьян
4.15. Получение клинических образцов вируса оспы коров
5. Результаты и обсуждение
5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для видоспецифичной мультиплексной ПЦР в реальном времени
5.2.Разработка метода видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени
5.3.Разработка моноплексного варианта ПЦР в реальном времени
5.4.Разработка мультиплексного варианта ПЦР в реальном времени
5.5. Оценка специфичности метода МПЦР в реальном времени
5.5. Оценка чувствительности метода МПЦР в реальном времени
6. Заключение
7. Выводы
8. Список литературы
1. Список используемых сокращений
БОЕ - бляшкообразующая единица
в.ч. - вирусная частица
ВОЗ (WHO) - Всемирная организация здравоохранения
ДМСО -диметилсульфоксид
е.а. - единица активности
ЗА - Западно-Африканский
ИФ - иммунофлюоресценция
ИФА - иммуноферментный анализ
МПЦР - мультиплексная полимеразная цепная реакция
ООЕ - оспинообразующая единица
ОРТ - открытая рамка трансляции
п.н. - пара нуклеотидов
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПКО - положительный контрольный образец
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РФ - Российская Федерация
СОП - стандартная операционная процедура
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
ЦА - Центрально-Африканский
ЦНС - центральная нервная система
ATI - эозинофильные включения типа A (A type inclusions)
CDC - Центр по контролю заболеваний и профилактике (Centers for Disease Control and Prévention)
CMLV- вирус оспы верблюдов CPXV - вирус оспы коров
crmB - ген, кодирующий модулятор цитокинового ответа В (Cytokine résistance modifier)
Су5 - Тетраметилиндодикарбоциашша сукцинимидный эфир
DFA - прямой анализ с использованием флюоресцирующих антител (direct fluorescent antibody assay)
dNTPs - дезоксинуклеозидтрифосфаты ECTV - вирус эктромелии БАМ - Карбоксифлуоресцеин
FDA - Центр по исследованию безопасности продуктов питания и лекарств, США (Food and Drug Administration)
Таблица 3.2. Методы детекции ОРУ, патогенных для человека, на основе ПЦР в реальном времени с резонансным переносом энергии между двух зондов,
Публикация
Видоспецифичный район генома, использованный для анализа
Выявляемый патоген
Диагностические характеристики
Апробация на ДНК VARV
Espy et al., 2

гемагглютинина/

Родоспецифичное выявление OPV, VARY
Специфичность метода не определялась.
Аналитическую чувствительность метода определяли на плазмидной ДНК, содержащей фрагмент гена гемагглютинина УАИУ.
Минимальное количество,
выявляемое методом, составило 5 -10 копий/реакции.

Несколько штаммов CPXV и CMLY имеют температуру плавления, идентичную с VARY.
Nitsche et al., 2
Rpo 18,
VETF,

Родоспецифичное выявление OPV (Rpo 18, VETF, A13L),
VARY (A13L)
Специфичность метода не определялась.
Аналитическую чувствительность метода определяли на плазмидной ДНК, содержащей фрагмент гена А13Ь УАКУ. Минимальное количество, выявляемое методом, составило 10 копий/реакции.

Данный метод был апробирован на клинических образцах от двух женщин, заразившихся оспой коров (Nitsche et al., 2007, Bonnekoh et al., 2008). Все образцы были адекватно определены.