Изучение адаптивных реакций клеток эпителия кишечника при культивировании в условиях микробиореактора

• Автор: Трушкин, Евгений Владиславович
• Шифр специальности: 03.03.01, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость работы
Положения, выносимые на защиту
Структура и объем диссертации
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Клеточная линия Сасо-2 как модель эпителия тонкого кишечника
1.2 Анализ данных микрочипов
1.3 Механизмы транспорта веществ через эпителий кишечника
1.4 Культивирование клеток на проницаемых мембранных фильтрах
1.5 Референсные гены в изучении процесса дифференцировки клеток линии Сасо-
1.6 Воздействие на клетки кишечника
1.7 Микробиореакторы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Реактивы
2.2 Культивирование клеточной линии Сасо-
2.2.1 Получение дифференцированной культуры клеток Сасо-
2.3 ГТЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени
2.4 Методы оценки стабильности экспрессии генов
2.5 Полногеномный транскриптомный анализ
2.5.2 Приготовление Second-strand Master Mix

2.5.3 In vitro транскрипция кРНК
2.5.4 Очистка кРНК
2.5.5 Синтез 2nd-cycle кДНК
2.5.6 Гидролиз с RNAse Н
2.5.7 Очистка 2nd-Cycle кДНК
2.6 Изучение транспорта веществ через монослой клеток Сасо-2
2.7 Обращенно-фазовая ВЭЖХ
2.8 Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ МОНОСЛОЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ САСО-
3.1 Изучение генетических особенностей клеток Сасо-2 до и после
диф ф еренцировки
3.1.1 Оценка стабильности экспрессии потенциальных референсных генов
3.2 Оценка изменения экспрессии специфических генов клеток Сасо-2
3.3 Оценка степени конфлюэнтности монослоя
3.4 Влияние дифференцировки клеток линии Сасо-2 на белки активного транспорта (по данным полногеномного анализа экспрессии)
ГЛАВА 4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В МИКРОБИОРЕАКТОРЕ
4.1 Преимущества культивирования в микрофлюидных системах
4.2. Влияние условий культивирования в микробиореакторе на функциональный статус клеток Сасо-
4.3. Полярность монослоя дифференцированных клеток Сасо-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БУ - блок управления
МБР - микробиореактор
ПЦР - полимеразная цепная реакция
АСТВ -ß-актин
В2М -бета-2-микроглобулин
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
GUS -глюкуронидаза
HPRT1 - гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза, гипоксантин
фосфорибозил-трансфераза I
HSPC3 - белок теплового шока HSP90-ß
MRPL19 -митохондриальный рибосомальный белок L
PSMC4 - АТФаза 4 26S протеасомы
PUM1 - РНК-связывающий белок семейства PUE
RPLPO - фосфопротеин РО
RPS18 - рибосомальный белок S
SDHA - субъединица А сукцинатдегидрогеназного комплекса SF3A1 -субъединица 1 сплайсинг фактора ЗА ТВР - ТАТА-блок связывающий белок UBC - убиквитин
YWHAZ - дзета полипептид тирозин 3-моноксигеназа/триптофан 5-монооксигеназа активирующего белка

Изменение проницаемости под действием различных веществ может происходить в течение промежутка времени от нескольких минут [Alhamoruni и др., 2010; Anderberg, Nystrom, Artursson, 1992; Muendoerfer и др., 2010] до нескольких суток [Guo и др., 2013; McRoberts, Riley, 1992; Бардин, Шубина, Мельникова, 2012].
Воздействие анионных (додецилсульфата или диоктилсульфосукцината натрия) или неионных (полисорбат 80 и полиоксил 40 гидрогенизированное касторовое масло) поверхностно-активных веществ, а также солей желчных кислот (таурохолат, тауродезокси холат и тауродигидроксифузидат натрия) увеличивает проницаемость монослоя клеток Сасо-2 и приводит к существенному изменению морфологии клеток - наблюдается снижение плотности микроворсинок, появляются отверстия в мембранах и внеклеточные образования. При низких концентрациях изменения обратимы и монослой восстанавливает свои свойства после окончания инкубации с исследуемыми веществами. Высокие концентрации поверхностно активных веществ приводят к лизису клеток [Anderberg, Nystrom, Artursson, 1992].
Натриевые соли жирных кислот часто используются с целью увеличения проницаемости эпителия кишечника для гидрофильных лекарственных средств. Действие этих веществ связано с регуляцией фосфолипаза С-зависимого метаболического пути [Lindmark, Kimura, Artursson, 1998; Tornita, Hayashi, Awazu, 1995].
Исследования на клетках Сасо-2 продемонстрировали, что в зависимости от длины цепи остатка жирной кислоты, механизм действия может быть различным. Так, воздействие солей каприновой и лауриновой кислоты приводит к увеличению проницаемости по парацеллюлярному механизму, при этом в первом случае происходит перераспределение белков плотных контактов ZO-1 и окклюдина, тогда как воздействие солями лауриновой кислоты не вызывает морфологических изменений [Lindmark и др., 1998; Lindmark, Kimura, Artursson, 1998].