Гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого и толстой кишки, и их диагностическое значение

• Автор: Рыков, Сергей Викторович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АД - аденокарцинома легкого
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНК-метилтрансфераза (DNMT)
ДСН - додецилсульфат натрия
ед. а. - единица активности
МРЛ - мелкоклеточный рак легкого
мРНК - матричная РНК
МС-ПЦР - метилспецифичная ПЦР
МЭГ - мобильные элементы генома
НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого
п.н. - пара нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РМЖ - рак молочной железы
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТК - рак толстой кишки
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
ТФ - транскрипционый фактор
ХЛЛ - хроническая лимфоцитарная лейкемия
AUC - Area Under Curve
CAGE - cap analysis of gene expression
DGCR8 - DiGeorge Syndrome Critical Region Gene-
DTT - дитиотреитол
HGC, High GC content
RISC- RNA-induced silencing complex
SAM - Б-аденозил-Ь-метионин
TSS - Transcription start site
UTR - untranslated region
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Метилирование СрО-островков у эукариот
1.1.1 Метилирование ДНК Общие сведения
1.1.2 Распределение Срй-динуклеотидов в геноме человека, функции СрО-
островков
1.1.3 Функции метилирования СрО-островков в зависимости от геномного
контекста
1.1.4 Группы генов и геномных элементов, инактивированные метилированием СрО-островков в норме
1.2. Метилирование ДНК и канцерогенез
1.2.1 Глобальное деметилирование генома опухолевой клетки
1.2.2 Гиперметилирование СрО-островков в геноме опухолевой клетки..
1.3. МикроРНК; гены, биогенез и механизм действия
1.4. МикроРНК и канцерогенез
1.5. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов микроРНК при онкопатологиях
1.6. Метилирование генов микроРНК при НМРЛ
1.7. Метилирование генов микроРНК при РТК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Сбор материала
2.2. Выделение геномной ДНК из ткани
2.3. Бисульфитная конверсия ДНК
2.3.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе
2.4. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР)
2.5. Бисульфитное секвенирование
2.5.1 Секвенирование продукта МС-ПЦР
2.5.2 Бисульфитное секвенирование
2.6. Статистическая обработка результатов
2.6.1 Точный тест Фишера
2.6.2 ЛОС-анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Исследование метилирования Срй-островков генов микроРНК приНМРЛ
3.1.1 Профиль метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ
3.1.2 Связь метилирования СрС-островков генов микроРНК с прогрессией НМРЛ
3.1.3 Секвенирование продукта МС-ПЦР, специфичного к метилированному аллелю бисульфит-конвертированной последовательности пиг-34Ь/с
3.1.4 Анализ метилирования локуса т1г-124а-3 методом бисульфитного секвенирования
3.2 Исследование метилирования Срв-островков генов микроРНК при РТК
3.2.1 Профиль метилирования 7 генов микроРНК при РТК
3.2.2 Связь метилирования СрС-островков генов микроРНК с прогрессией РТК
3.3 Роль метилирования изученных генов микроРНК в патогенезе опухолей
3.4 Диагностическое применение систем маркеров, основанных на анализе метилирования генов микроРНК, при НМРЛ и РТК
3.4.1 Системы маркеров для диагностики НМРЛ
3.4.2 Система маркеров для диагностики РТК
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

толстой кишки (п=68), в 81.4% первичных злокачественных новообразований толстой кишки (п=160), в 14.4% гистологически нормальной ткани толстой кишки (п=160) и в 4.7% в ткани толстой кишки от доноров без онкопатологий и, следовательно, метилирование mir-137 является опухоль-специфическим событием. Экспрессия mir-137 характерна для колоноцитов в нормальном кишечном эпителии и обратно коррелирует с уровнем метилирования гена. Трансфекция клеточной культуры колоректального рака синтетической mir-137 подавляет процессы пролиферации. Показано, что к мишеням mir-137 относится ген LSD-1 {Balaguer et al., 2010).
Метилирование CpG-островка промотора mir-34a обнаружено в 3 из 23 (13%) клеточных линий РТК {Lodygin et al., 2008). На клеточных линиях и тканях первичного рака толстой кишки показан низкий уровнь содержания mir-124а и mir-34b/c, ассоциированный с метилированием генов этих микроРНК и восстановлением экспрессии после обработки 5-азацитидином. Определена высокая частота метилирования генов семейства mir-124а (88% в клеточных линиях и 99% в первичных опухолях) и гена mir-34b/c (89% в клеточных линиях и 93% в первичных опухолях) при РТК. Подтипы РТК и все гистологические типы полипов толстой кишки показывают высокую частоту метилирования генов семейства mir-124а и локуса mir-34b/c, а также метилирование генов семейства mir-124а (59%) и генов mir-34b/c (26%) наблюдается в гистологически нормальной ткани у пациентов с РТК, но не наблюдается в ткани толстой кишки у пациентов без онкопатологий или с колитами. Метилирование генов семейства mir-124а в гистологически нормальной ткани ассоциировано с микросателлитной нестабильностью {Deng et al., 2011). Определена роль метилирования CpG-островков промоторных участков в регуляции экспрессии генов семейства mir-124а при РТК. Гиперметилирование промоторов mir-124a-l/-2/-3 обнаружено с частотой 75% (42/56) в первичных опухолях РТК, 100% (7/7) в клеточных линиях РТК и 0% (0/10) в ткани толстой кишки от доноров без онкопатологий {Lujambio et al., 2007).
Анализ гена mir-345 при РТК показывает высокий уровень метилирования в опухолях по сравнению с гистологически нормальной тканью, экспрессия mir-345 подавлена в 51.6% случаев РТК по сравнению с нормой, и ассоциирована с метастазами в лимфоузлах и гистологическим типом с плохим прогнозом {Tang et