Биологические эффекты полной и частичной инактивации функций соматического цитохрома C на модели генетически модифицированных мышей

• Автор: Муфазалов, Ильгиз Альбертович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

1 ОГЛАВЛЕНИЕ
| 1 ОГЛАВЛЕНИЕ
; 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
3 ВВЕДЕНИЕ
| 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I - 4ШОбщая характеристикащитохрома
Й- ' ' '

! 4.2 Участие цитохрома С в-апоптозе
! 4.2.1 История вопроса
| 4.2.2 Мобилизация цитохрома С
I 4.2.3 Транслокация-через внешнюю'мембрану
• 4.2.5 Формирование и функционирование апоптосомы
4;3'Функциизотдельных аминокислотных остатков в молекуле | цитохрома С
I " '
5 МАТЕРИАЛ Ы II МЕТОДЫ 11ССЛЕДОВАН ИЙ,
| 5Л'1Ферментьпи реактивы*
| 5.2 Мыши и их генотипирование
5.3 Радиоактивное мечение проб ИгСаузерн блог гибридизация
5.4 Выделение эмбрионов на разных сроках внутриутробного развития35
5.5 Получение и?культивирование эмбриональных фибробластов мыши
5;6 Измерение экспрессиизгенов соматической и тестикулярношизоформ
§ цитохрома С
' . Г.
5;7 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК
I ' '
5.8 Измерение скорости дыхании эмбриональных фибропластов мыши 38’
I 5Л'Цитотоксическиипгест

1 ’
5.10 Иммуноцитохимия

| 5.1ТПроточная цитофлуориметрия

/ 5;12 Гистологический;анализ серийных срезов головного мозга

г ', '
г : '

5.13 Нейрофизиологические тесты
5.14 Макроанатомический анализ развития некоторых лимфоидных органов
6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
6.1 Получение мутагенезирующего конструкта для гомологичной рекомбинации
6.2 Электропорация, отбор положительных клонов и инъекция в бластоцисты
6.3 Получение мышей>с полной инактивацией функций цитохрома С .. 50'
6.4'Особенности биологии развития мышейс нарушенной экспрессией' гена цитохрома С
6.5 Получение мышей с частичной инактивациешфункции цитохрома С
6.6 Особенности биологии мышей, экспрессирующих соматический цитохром С с заменой.лизина.в 72 положении на триптофан
6.6.1 Особенности биологии развития KW/KW мышей
6.6.2 Особенности нейроанатомии KW/KW мышей
6.6.3 Особенности нейрофизиологии KW/KW-мышей
6.6.4 Особенности развития некоторых лимфоидных органов KW/KW мышей
6.7 Свойства эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ) с частичной инактивацией функций цитохрома С
6.7.1 Получение МЭФ из KW/KW мышейанализ экспрессии и локализации цитохрома С
6.7.2 Изучение функции дыхания МЭФ
6.7.3 Изучение действия различных проапоптотических индукторов на культуры МЭФ
7 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
8 ВЫВОДЫ
9 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
10 БЛАГОДАРНОСТИ

2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДТт - митохондриальный трансмембранный потенциал 4HNE - 4-Hydroxynonenal (4-гидроксиноненал)
Apaf-1 - Apoptotic protease activating factor 1 (апоптотический фактор активации протеаз -1)
DISC - death-inducting signaling complex (сигнальный комплекс индуцирующий клеточную гибель)
Hsp - heat shock protein (белок теплового шока)
Smac - second mitochondria-derived activator of caspase (второй митохондриальный активатор каспаз)
TRAIL - TNF-related apoptosis-inducing ligand (близкородственный к ФНО лиганд, индуцирующий апоптоз)
WT - wild type (аллель дикого типа)
XIAP - X-linked Inhibitor of Apoptosis (связанный с Х-хромосомой ингибитор апоптоза)
АФК - активные формы кислорода
МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. — пары нуклеотидов
ФНО - фактор некроза опухолей
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Аминокислотные остатки представлены в однобуквенном коде
Дни онтогенеза: Е - эмбриональный период, Р - постнатальный период

накапливающим экраном (Cyclone™ Storage Phosphor Screen) в течение 24 часов.
5.4 Выделение эмбрионов на разных сроках внутриутробного
развития
Для получения датированной беременности самок подсаживали к самцу (2 : 1) на ночь, утром проверяли наличие копулятивной пробки. Момент обнаружения копулятивной пробки» считали 0.5-м днем беременности. При достижении желаемого срока беременности мышь эвтаназировали; извлекали матку, выделяли эмбрионы и удаляли внезародышевые оболочки с помощью' микрохирургических инструментов: При работе' с ранними эмбрионами (Е9.5) манипуляции проводили под контролем светового диссекционного микроскопа Leica Stereo Zoom 6 Photo.
5.5 Получение и культивирование эмбриональных фибробластов
мыши
МЭФы с гомозиготной мутацией K72W в гене соматического цитохрома-С получали из эмбрионов от скрещивания гетерозиготных и/или гомозиготных по этой мутации мышей. При достижении 13.5* дней беременности мышь эвтаназировали, извлекали матку, у эмбрионов удаляли голову и внутренние органы, оставшиеся ткани измельчали глазными ножницами, диссоциировали в 0.05%-ном растворе трипсии/ЭДТА- и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, а затем клеточную суспензию переносили во флакон площадью 25 см2 для адгезивных культур (“Grenier”). Далее клетки культивировали в.среде DMEM, содержащей 4.5 г/л глюкозы (“HyClone”) и 10% фетальной сыворотки крупного рогатого» скота (“HyClone”), при 37°С в условиях 5% ОСЬ и 95%-ной влажности. При достижении 80-85% монослоя клетки рассевали в соотношении 1 : 3, часть клеточного материала использовали для выделения ДНК и генотипирования [Муфазалов и др., 2009; Галимов и др., 2008].