Анализ нуклеотидных последовательностей геномов ВИЧ-1, выделенных в России

• Автор: Барышев, Павел Борисович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Структура генома ВИЧ-
1Л Л. Некодирующая область ВИЧ-
1Л .2. Структурные гены ВИЧ-
1Л .3. Неструктурные гены ВИЧ-
1.2. Вариабельность генома ВИЧ-
1.2.1. Мутационная изменчивость
1.2.2. Рекомбинационная изменчивость
1.3. Классификация ВИЧ-
1.4. Значение генетического разнообразия ВИЧ-
1.5. Способы исследования полноразмерных геномов ВИЧ-
1.5.1. Секвенирование полноразмерных геномов ВИЧ-
1.5.2. Методы филогенетического анализа
1.5.3. Методы рекомбинационного анализа
1.6. Характеристика эпидемии ВИЧ-инфекции в России
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Практическая часть
2.1.1. Образцы крови
2.1.2. Выделение РНК ВИЧ-
2.1.3. Получение кДНК
2.1.4. Амплификация фрагментов геномов ВИЧ-
2.1.4.1. Подбор праймеров
2.1.4.2. Схемы амплификации
2.1.4.3. Условия ПЦР
2.1.5. Методы электрофореза ДНК
2.1.5.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле
2.1.5.2. Препаративный электрофорез ДНК в легкоплавкой агарозе
2.1.6. Очистка продуктов ПЦР
2.1.7. Секвенирование геномов ВИЧ-
2.2. Теоретический анализ
2.2.1. Сбор данных для проведения компьютерного анализа
2.2.2. Построение множественного выравнивания
2.2.3. Первичный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.5. Рекомбинационный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.6. Анализ адаптивной молекулярной эволюции
2.2.7. Статистическая обработка полученных результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Получение нуклеотидных последовательностей полноразмерных
геномов ВИЧ-

3.2. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов ВИЧ-1 .
3.2.1. Анализ нуклеотидного состава геномов ВИЧ-
3.2.2. Вариабельность различных участков геномов ВИЧ-
3.2.3. Филогенетический анализ полноразмерных геномов ВИЧ-1
3.2.3.1. Определение параметров филогенетического анализа
3.2.3.2. Анализ филогенетических деревьев
3.2.3.3. Определение эволюционных дистанций
3.2.4. Рекомбинационный анализ полноразмерных геномов ВИЧ-1
3.2.4.1. Определение точек рекомбинации программой]рНММ
3.2.4.2. Сравнение результатов работы программ Иессо и ]рНММ
3.2.4.3. Исследование гипотезы о дополнительной рекомбинации между субтипом А и СКБ02 Ав ВИЧ-1
3.3. Анализ гена ро
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования
Россия и окружающие ее страны бывшего Советского Союза занимают одну из лидирующих позиций в мире по скорости распространения эпидемии. По данным Объединенной программы ООН по СПИДу на декабрь 2011 года доля ВИЧ-инфицированных в регионе Восточной Европы и Центральной Азии, к которому относят и Россию, составляет около 4%, причем доля ВИЧ-инфицированных, приходящихся на нашу страну, превышает 52% (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS, 2012). Несмотря на это генетические исследования современных циркулирующих в стране вариантов ВИЧ-1 осуществляются недостаточно. Например, в международной базе данных (Los Alamos HIV Sequence database) на сентябрь 2012 года было представлено 622 последовательности полных геномов ВИЧ-1, выделенных от жителей Северной и 242 последовательности от лиц, проживающих в Южной и Центральной Америках, 438 последовательностей геномов ВИЧ-1 происходят из Центральной и Западной Европы. Российских расшифрованных полных геномов ВИЧ-1 было доступно лишь 11. Из них всего 7 геномов (3 генома субтипа А и 4 - субтипа В) принадлежат к эпидемически значимым для страны генетическим вариантам ВИЧ-1, которые были выделены от лиц, инфицированных в начале 2000-х.
По мере развития пандемии ВИЧ-инфекции наблюдаются не только количественные, но и качественные изменения, т. е. происходит усложнение вирусной популяции из-за возникновения новых вариантов вируса, зачастую обладающих неизвестными и малоизученными свойствами. Примером этого может служить эпидемическая ситуация в Новосибирской области (НСО). До недавнего времени основными генетическими вариантами, определяющими эпидемию ВИЧ-инфекции в НСО, были субтипы А и В ВИЧ-1 (Bobkov A. et al., 1998; Vinogradova A. et al., 2010; Fernandez-Garcia A. et al., 2012). При этом на субтип А приходилось большинство случаев инфицирования людей (более 95%), распространенность субтипа В колебалась в пределах 4-6%, как и в других регионах России. Однако с 2006 г. на территории НСО начинают

последовательностями различий. Этот метод подразумевает, что для анализируемой группы последовательностей может существовать и несколько различных деревьев, равновероятно объясняющих наблюдаемые различия. Изначально метод был предложен для анализа аминокислотных последовательностей [148], а впоследствии модифицирован Фитчем для анализа нуклеотидных последовательностей [149]. В основе этого метода лежит анализ нуклеотидов или аминокислот, находящихся в так называемых филогенетически информативных позициях последовательностей. Информативными называются те позиции, состояние которых, т.е. находящиеся в этой позиции нуклеотиды или аминокислоты, позволяет отдать предпочтение тому или иному филогенетическому дереву (сценарию эволюции). Т.е. информативными являются те позиции, в которых у анализируемых последовательностей находятся два или больше различных нуклеотидов (аминокислот) и как минимум два из них присутствуют у двух или более последовательностей. Таким образом, процедура поиска заключается, во-первых, в необходимости идентифицировать все информативные позиции, во-вторых, для каждого возможного дерева рассчитать минимальное необходимое число замен в каждой информативной позиции и просуммировать их по всем позициям. Наконец, из всех возможных деревьев нужно выбрать то, для которого эта сумма минимальна.
Метод максимального правдоподобия (МЬ), изначально предложенный для анализа данных о частотах генов, был впоследствии модифицирован Фельзенштейном для анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей [150, 151]. В отличие от метода максимальной экономии метод максимального правдоподобия, как и дистанционные филогенетические методы, базируется на использовании моделей эволюции. Однако в отличие от дистанционных методов он использует эти модели для построения филогенетического дерева, исходя из оценки вероятности нахождения каждого конкретного нуклеотида (аминокислоты) в каждой конкретной позиции. Основу метода составляет функция правдоподобия, выражающая плотность вероятности совместного появления данных (набора нуклеотидов или аминокислот в некой