Исследование дофамина как молекулярного инструмента для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках

• Автор: Парнышкова, Екатерина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 121 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Дофаминовые рецепторы
1.1.1. Локализация дофаминовых рецеторов
1.2. Актин: глобулярная и фибриллярная формы
1.2.1. Динамика актина в клетке
1.2.2. Ядерный актин
1.3. Актин: содержание катионов
1.4. Полимеризация актина
1.4.1. Скорость и степень полимеризации актина
1.4.2. Актин связывающие белки
1.4.3. Г-актин связывающие белки
1.4.4. Влияние цитохалазинов и фаллоидина на полимеризацию актина
1.5. Цитоскелет трансформированной клетки
1.6. Существующие микроскопичесике подходы для визуализации актина
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования
2.1. Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином in vitro
2.2. Культивирование клеток in vitro и оценка их выживаемости
2.3. Культивирование in vivo клеток асцитной карциномы Эрлиха
2.4. Морфологические исследования культур клеток
2.5. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток
2.6. Деполимеризация актина под действием цитохолазина В и глутамата
2.7. Взаимодействие дофамина с выделенным Г-актином в модельных экспериментах
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. Влияние дофамина на состояние актина в живых клетках
3.1. Ультраструктурное исследование изменения состояния актина
под воздействием дофамин в трансформированных клетках
3.1.2. Цитохимическая визуализация дофамина внутри клеток BALB/3T3 и 3T3B-SV40
3.2. Влияние дофамина на состояние выделенного Г-актина
3.2.1. Ультраструктура препаратов актина
3.2.2. Визуализация актодофаминового комплекса
3.2.3. Подсчёт количества Г-актина
3.3. Исследование морфофункциональной организации клеток разной природы при действии дофамина
3.3.1. Влияние дофамина на жизнеспособность и морфологию прикрепляющихся и суспензионных культур
3.3.2. Эффект дофамина на морфологию клеток
3.4. Ультраструктура злокачественных клеток до и после воздействия дофамина
3.4.1. Исследование ультраструктуры раковых клеток HEP-2 in vitro
3.4.2. Исследование ультраструктуры раковых клеток ТНР-1 in vitro
3.4.3. Исследование ультраструктуры раковых клеток АКЭ in 85 vivo
3.5. Визуализация актодофаминового комплекса в 89 злокачественных клетках различного типа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актин существует в клетке в фибриллярном (Ф-) и глобулярном (Г-)
состояниях и составляет 5-15% от ее сухого веса (Страйер, 1984). Актин
участвует в построении актинового цитоскелета и, тем самым, играет
важную роль в выполнении ряда важнейших функций: организации
пространственного расположения внутриклеточных структур,
взаимодействии клетки с внешней средой, генерации силы, обеспечивающей
движение клетки и ее формообразование (Fletcher, Mullins, 2010). Кроме
этого, актин служит основой внутриклеточного и межклеточного транспорта
и сигнализации, формирования и хранения структурных следов адаптации и
памяти (Крутецкая и др., 2003; Павлик, 2004; Корее et al., 2006; Тирас, 2007;
Bestman, Cline 2008; Bressloff, Eamshaw 2009). Изменение соотношения Г
Ф-актина вызывает изменение всех выше приведенных клеточных функций,
в том числе и внутриклеточного транспорта (Weisswange et al., 2006).
Состояние актина в клетке может изменяться под влиянием эндогенных
процессов, сопряженных с действием внешних факторов (Браун, Моженок
1987), поэтому крайне важно выявлять такие изменения. Существенный
вклад в исследованиях роли актина в жизнедеятельности клеток занимает
микроскопия. Существующие методы, использующие белки и пептиды,
меченные флуорофорами, пероксидазой, флуоресцирующими белками или
коллоидным золотом, оптическую регистрацию двухфотонной микроскопией
флуоресценции резонансного переноса энергии между актиновыми
мономерами, позволяют избирательно и раздельно визуализировать Г- и Ф-
актин внутри живых и фиксированных клеток и изучать динамику
актинового цитоскелета (Moshkov et al., 1980; Tiras et al., 1992; Cao et al
1993; Shaffer et al., 1998; Hodgson et al., 2000; Reddy 2001; Okamoto, Hayashi,
2006; Anderi, Schmid, 2007; Koestler et al., 2009; Uttamapinant et al., 2010; Riedl
et al., 2010; Kiuchi et al., 2011; Du, Ren, 2011; Dovas et al., 2011; Fan et al
2012; Gunewardene et al., 2012; Thon, Italiano, 2012). К сожалению, из-за
непроницаемости плазматической мембраны для меченых конъюгатов, как

2004). АДФ/кофилины остаются связанными с диссоциировавшими мономерами, постепенно освобождая их для взаимодействия с другими актин-связывающими белками. Они также препятствуют спонтанной нуклеотидной замене в мономерах актина, поддерживая их в неподходящем для полимеризации состоянии.
1.4.4. ВЛИЯНИЕ ЦИТОХАЛАЗИНОВ И ФАЛЛОИДИНА НА ПОЛИМЕРИЗАЦИЮ АКТИНА
При полимеризации Г-актина в Ф-актин ориентация всех мономеров одинакова, поэтому Ф-актин обладает полярностью. Волокна актина имеют два разноимённо зараженных конца (+ и -), которые полимеризуются с различной скоростью. Эти концы не стабилизированы специальными белками (как, например, в мышечных клетках), и при критической концентрации Г-актина «+»-конец будет удлиняться, а «-»-конец укорачиваться. В условиях эксперимента этот процесс может быть ингибирован токсинами грибов, связывающимися с актином и блокирующими его полимеризацию, нарушая тем самым подвижность клеток, фагоцитоз и цитокинез: цитохалазины, фаллоидин, латрункулин и толитоксин (рис. 5).
Цитохалазины - группа родственных по химической структуре метаболитов плесневых грибов (Tanenbaum, 1978). Функционально цитохалазины напоминают кэпирующие белки. Они связываются с (+)-концом (быстро растущим) актинового филамента и блокируют как присоединение, так и отсоединение субъединиц на этом конце, хотя блокирование может быть неполным (Bonder, Mooseker, 1986; Brown, Spudich, 1982; Maclean-Fletcher, Pollard, 1980). На процесс элонгации актинового филамента с острого (медленно растущего) конца цитохалазины не влияют (Bonder, Mooseker, 1986; Maclean-Fletcher, Pollard, 1980). Цитохалазины могут также разрезать актиновоые филаменты. Наиболее активным является цитохалазин D (Urbanic, Ware, 1989).